​蛋白纯化步骤（实验技能丨2种常用的蛋白纯化的方法）

蛋白纯化步骤（实验技能丨2种常用的蛋白纯化的方法）

蛋白纯化技术是生物研究领域的一项重要技术。要研究某一个特殊蛋白质，首先就要将这个蛋白从生物体中分离纯化出来。蛋白纯化方法主要是利用不同蛋白质间的相似性与差异，依据蛋白间的相似性可以去除非蛋白物质，再根据蛋白质的差异性将目的蛋白分离出来。在本文中，我们将介绍2种常用的蛋白纯化的方法。

Ni柱亲和层析

1、自制的简易柱子，直径约为1cm，长度约为2cm，在柱子的下端加入蒸馏水，并关闭柱子的出口。

2、将琼脂糖凝胶倒入柱子，让填料自然沉降，依次用二到五倍的柱子体积的无菌水、8mol/L的尿素、无菌水洗柱子。

3、缓慢加入5ml的硫酸镍，至柱子的颜色由白色变为蓝色，待蓝绿色收集液体滴下来为止。

4、用二到五倍体积的PBS缓冲液平衡柱子，再将粗蛋白样品进行上样，用梯度浓度50mmol/L、70mmol/L、150mmol/L、250mmol/L咪唑进行过柱，流速约为1ml/min。

5、以每个浓度用1.5ml的Eppendorf收集八管，再用二到五倍体积的无菌水洗柱子，再用二到五倍的50mmol/L的EDTA洗柱子，除去NiSO4，待至无色状态

6、用多倍体积的无菌水进行洗柱子，将手机液10%的分离胶进行SDS—PAGE分析。

离子交换层析

1、将macro prep High-Q强阴离子交换填料混匀，吸取16 ml于小烧杯中，静置待填料沉降至烧杯底部，吸取并弃去上清。

2、在烧杯中加入4倍体积的ddH2O，混匀，静置，沉降后去上清。重复2次以充分洗去保存填料中的乙醇。

3、在空柱中加入柱体积10%的装柱缓冲液，静置除去可能存在于柱壁和柱底部薄膜上的气泡。

4、以1:1（v/v）比例在烧杯中加入装柱缓冲液（20 mM sodium phosphate, pH 7.0, 1 M NaCl），混匀。用玻璃棒引流加入至柱中，并用装柱缓冲液填满剩余柱体积。静置30 min。

5、待填料均沉降至柱底部后，将适配器以较小的倾斜角度插入至柱中填料顶部。

（1）打开柱低端开口，以最大流速10 ml/min泵入装柱缓冲液，压实填料。

（2）缓慢降低缓冲液的流速，并将装柱缓冲液更换成结合缓冲液（20 mM sodium phosphate, pH 7.0）。

（3）设定蛋白纯化程序，使用15倍柱体积缓冲液线性梯度洗脱目的蛋白。

（4）收集流出液，进行SDS-PAGE检测。

（注意：所有层析所需的溶液以及蛋白样品都需要使用0.22 μm的滤膜过滤，少量的溶液或蛋白样品需要可使用针头滤器，大量的溶液需要使用506的溶剂过滤器进行过滤。）